东华大学沈明武/史向阳课题组《ACS AMI》：细胞膜包覆的响应型碳点纳米团簇作为“子母弹”用于增强的肿瘤诊疗

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开发可实现癌症精准诊疗的新型纳米药物，以克服传统小分子化疗药物的缺陷，提高其生物利用度和治疗效果至关重要。然而，纳米药物在进入体内后会遇到一系列生理屏障，例如网状内皮系统（RES）的快速清除、肿瘤部位渗透深度不佳等，阻碍了其在肿瘤部位的有效积累。近年来，继承了肿瘤细胞表面膜蛋白的肿瘤细胞膜被广泛用于构建仿生纳米平台，赋予其肿瘤同源靶向性、免疫逃避能力及延长的血液循环时间。另一方面，尺寸较大的纳米平台往往通过高渗透长滞留（Enhanced permeability and retention effect, EPR）效应在肿瘤部位聚集，而尺寸较小的纳米颗粒通常具有更强的肿瘤渗透能力。因此，可利用肿瘤微环境与正常生理微环境的差异，设计刺激响应型尺寸可变的纳米药物，同时实现其在肿瘤部位的有效积累及增强渗透，并且响应性释放药物，达到精准诊疗的目的。
在众多已开发的纳米平台中，碳点（Carbon dots，CDs）因具有生物相容性好、水溶性好、荧光稳定性好等特点被广泛用于肿瘤诊疗。碳点既可利用自身的荧光作为造影剂用于荧光成像，也可以作为药物载体将治疗药物递送至肿瘤部位。在最近的工作中，东华大学史向阳教授团队将具有黄色荧光的碳点与第五代树状大分子结合，并负载化疗药物，构建了双载药的树状大分子/碳点纳米杂化材料。同时，结合超声靶向微泡破坏技术，增强材料在肿瘤部位的积累，有效抑制小鼠体内多药耐药肿瘤的生长，并利用碳点进行了动物体内荧光成像，实现了肿瘤诊疗一体化（Bioact. Mater. 2021, 6, 729-739）。然而，碳点虽然具有稳定的荧光及较强的肿瘤渗透能力，但过小的尺寸（小于10 nm）导致其在体内血液循环时间短、易被代谢清除，因此为了达到肿瘤部位的有效积累，实现碳点成像及治疗效果的最大化，尚需和其它技术如超声靶向微泡破坏技术结合，因而也增加了治疗过程的复杂性。
为了克服一系列体内的生理屏障，并充分利用碳点的优异特性，实现纳米药物的长循环、基于放大的EPR效应的肿瘤被动靶向和基于细胞膜仿生的肿瘤同源主动靶向、药物的高效负载、肿瘤的增强渗透、响应性药物释放及响应性的肿瘤荧光成像，东华大学沈明武/史向阳教授团队构建了一种癌细胞膜包覆的响应型黄色荧光碳点纳米团簇作为“子母弹”用于肿瘤的精准荧光成像及靶向化疗（图1）。
研究团队首先通过一步水热法合成粒径为7.2 nm的黄色荧光碳点（y-CDs），随后利用含有二硫键的胱胺二盐酸盐（Cys）将y-CDs交联，得到粒径为150 nm的具有还原响应性的碳点纳米团簇（y-CDCs）。形成的y-CDCs可通过物理作用在y-CDs表面或内部负载抗癌药物阿霉素（DOX），并且具有较高的药物上载率（81%）。随后在y-CDCs/DOX表面包覆癌细胞膜（CCM）制得y-CDCs/DOX@CCM，包覆在y-CDCs/DOX表面的膜厚度为12.8 nm。
 
图1. y-CDCs/DOX@CCM纳米复合物的制备及其用于肿瘤精准荧光成像及靶向化疗示意图。 研究结果表明，制备的y-CDCs/DOX@CCM在模拟的肿瘤微环境中（pH = 5.5, 10 mM GSH），可以响应解离使粒径恢复至与单独y-CDs相近的9.4 nm，荧光强度恢复至与单独y-CDs相近的水平，同时高效释放负载的DOX（释放率为88%），从而增强y-CDs及DOX在肿瘤微环境中的渗透能力并动态恢复荧光。在细胞毒性的实验中，CCM的包覆使y-CDCs/DOX@CCM的半数抑制浓度（IC₅₀，6.3 μg/mL）显著低于未包膜的y-CDCs/DOX（11.3 μg/mL）；同时，在细胞吞噬实验中，y-CDCs/DOX@CCM相比未包膜的y-CDCs/DOX及包覆红细胞膜的y-CDCs/DOX@RBCM，在肿瘤细胞（B16）中具有最高的吞噬量并在巨噬细胞（RAW264.7）中具有最低的吞噬量，证明了CCM的包覆可使y-CDCs/DOX@CCM具备免疫逃避能力及肿瘤同源靶向性，从而提高了制备的纳米药物在肿瘤细胞中的积累，增强了对肿瘤细胞的抑制作用。体内的药代动力学结果表明，y-CDCs/DOX@CCM的血液半衰期为3.57 h，明显长于y-CDCs/DOX的血液半衰期（1.44 h），进一步验证了CCM赋予的免疫逃避能力可使y-CDCs/DOX@CCM具有延长的血液循环时间。
在体外3D细胞球模型中，还原响应的y-CDCs与非还原响应的 y-CDCs（利用不含二硫键的乙二胺交联制得）相比，渗透性能更好，在细胞球内部也能显示较强的荧光，证明了响应型y-CDCs在肿瘤微环境中的尺寸变化，可有效增强其在肿瘤部位的渗透（图2a-b）。小鼠体内及离体荧光成像结果表明，尺寸较大的y-CDCs由于放大的EPR效应可在肿瘤中有效积累，并且荧光淬灭的y-CDCs可在肿瘤部位响应解离，恢复成荧光较强的y-CDs，对肿瘤进行荧光成像。而制备的y-CDCs@CCM由于CCM的包覆，具备了肿瘤同源靶向性及延长的血液循环时间，因此具有更好的肿瘤荧光成像效果（图2c-d）。肿瘤切片的免疫荧光染色结果也进一步证明y-CDCs@CCM具有增强的肿瘤积累及渗透能力（图2e）。
 
图2. 3D细胞球与不同材料共孵育后的（a）激光共聚焦显微镜图像及（b）荧光强度曲线。荷瘤鼠经尾静脉注射不同材料后（c）体内及（d）离体荧光成像图（1：心，2：肝，3：脾，4：肺，5：肾，6：肿瘤）。（e）荧光成像后各组肿瘤切片的免疫荧光染色图（DAPI用于标记细胞核，CD34用于标记血管）。 随后，研究团队探索了将制备的y-CDCs/DOX@CCM用于皮下瘤模型化疗的可能性。研究发现，14天治疗结束后，y-CDCs/DOX@CCM治疗组的肿瘤重量及肿瘤体积最小，肿瘤抑制效果最好。对肿瘤切片进行H&E及TUNEL染色发现，y-CDCs/DOX@CCM治疗组的肿瘤细胞坏死及凋亡明显高于其它治疗组，肿瘤细胞凋亡率达到了74.2%（图3）。治疗结束后，对各组小鼠的体内主要器官进行H&E染色，y-CDCs/DOX@CCM组各器官均未发现明显损伤，表明制备的y-CDCs/DOX@CCM具有良好的生物安全性。这些研究成果结果表明，制备的y-CDCs/DOX@CCM可通过靶向作用聚集在肿瘤部位，使荧光淬灭的y-CDCs响应性解离，恢复为荧光较强的y-CDs，同时释放负载的DOX，提高DOX的化疗效果，降低毒副作用，从而实现对肿瘤的高效荧光成像及化疗。
 
图3. （a）小鼠体内治疗过程示意图。各组经尾静脉注射治疗14天后的（b）肿瘤重量及（c）肿瘤照片。各治疗组小鼠在治疗期间的（d）相对肿瘤体积及（e）体重变化。（f）各治疗组的肿瘤切片染色。
该研究设计的新型纳米平台具备多方面的优势：1）构建的y-CDCs利用其团簇结构获得较高的药物上载率，并且由于尺寸放大的EPR效应、癌细胞膜介导的抗蛋白吸附能力获得了增强的肿瘤积累及延长的血液循环时间；2）在还原性肿瘤微环境中，荧光淬灭的y-CDCs可以解离成为荧光较强且具有增强的肿瘤渗透能力的y-CDs，从而在肿瘤部位动态“开启”荧光成像，同时快速释放负载的DOX，并促进DOX在肿瘤部位的渗透，对肿瘤进行高效的荧光成像及化疗；3）表面包覆的癌细胞膜赋予了纳米平台肿瘤主动靶向性及免疫逃避能力。该研究制备的y-CDCs/DOX@CCM为构建新型诊疗一体化纳米平台提供了新的思路。
以上研究成果以“Cluster Bomb” Based on Redox-Responsive Carbon Dot Nanoclusters Coated with Cell Membranes for Enhanced Tumor Theranostics”为题，发表于美国化学会著名期刊ACS Applied Materials & Interfaces (DOI: 10.1021/acsami.1c15282)。东华大学化学化工与生物工程学院史向阳教授与沈明武教授为共同通讯作者，博士生郭云琦为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委面上项目、上海市科委政府间国际合作项目、上海市科委优秀学术带头人计划及中央高校研究生创新基金等项目的资助。

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.1c15282.

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